做好對照

正式試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)分別以陽性對照與陰性對照控制試驗(yàn)條件，待檢樣品應(yīng)作一式二份，以實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。有時(shí)本底較高，說明有非特反應(yīng)，可采用羊、兔或BSA等封閉。

測定技術(shù)的基礎(chǔ)在于抗原之間的特異結(jié)合反應(yīng)，所以任何的診斷試劑離不開的原料，如抗原，酶等。以前用于測定的抗原通常為各種純化抗原，而則為純化抗原動(dòng)物后的多克隆和使用雜交瘤技術(shù)的單克隆，而抗原或的標(biāo)記物如酶標(biāo)結(jié)合物則通過各種化學(xué)合成制備。近年來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，使用基因工程制備各種特殊的抗原或及其酶結(jié)合物等測定試劑幾成為現(xiàn)實(shí)的新一代試劑，各種新型使用的測定也不斷出現(xiàn)。

ELISA試劑盒的操作步驟如下：1.包被：用PH9.6的CBS包被液稀釋包被抗原至5μg/ml，酶標(biāo)板中每孔加入50μl，室溫、4℃或37℃過夜包被。2.洗滌：棄包被液（拍干，再用無塵紙吸干），用PH7.2-7.4的1×PBST洗滌液洗板3次（每孔均要加滿），每次3min~5min。3.封閉：每孔加封閉液（1%BSA）250μl，37℃封閉2h。4.洗滌：用1×PBST洗滌液洗板3次，每次3min~5min。5.結(jié)合一抗：用1×PBST緩沖液1∶1000稀釋被檢，每孔100μl，要設(shè)立陰性對照，37℃孵育1.5h。6.洗滌：同上。7.結(jié)合酶標(biāo)二抗：每孔加1×PBST緩沖液1000倍稀釋的酶標(biāo)二抗羊抗鼠IgG-HRP（稀釋倍數(shù)根據(jù)產(chǎn)品不同有所不同，可按說明書進(jìn)行）50μl，37℃孵育1h.8.洗滌：同上。9.顯色：每孔加底物溶液（TMB）50μl，置室溫避光顯色10min。10.待顯色后，每孔加入50μl終止液（2mol/L H2SO4）終止反應(yīng)。使用酶標(biāo)儀讀取450nm的OD值，以確定水平。以上步驟僅供參考，具體操作請根據(jù)實(shí)際情況和產(chǎn)品說明書進(jìn)行。

牛絲氨酸蛋白酶33(PRSS33)ELISA試劑盒

實(shí)驗(yàn)條件的選擇

在ELISA中，進(jìn)行各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)條件的選擇是很重要的，其中包括:

（1）　固相載體的選擇：許多可作為固相載體，如聚氯、聚、聚丙酰胺和纖維素等。其形式可以是凹孔平板、試管、珠粒等。常用的是40孔聚凹孔板。不管何種載體，在使用前均可進(jìn)行篩選：用等量抗原包被，在同一實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行反應(yīng)，觀察其顯色反應(yīng)是否均一性，據(jù)此判明其吸附性能是否良好。

（2） 包被（或抗原）的選擇：將（或抗原）吸附在固相載體表面時(shí)，要求純度要好,吸附時(shí)一般要求PH在9.0～9.6之間。吸附溫度，時(shí)間及其蛋白量也有一定影響,一般多采用4℃ 18～24小時(shí)。蛋白質(zhì)包被的適濃度需進(jìn)行滴定：即用不同的蛋白質(zhì)濃度（0.1、1.0和10μg/ml等）進(jìn)行包被后，在其它試驗(yàn)條件相同時(shí)，觀察陽性標(biāo)本的OD值。選擇OD而蛋白量少的濃度。對于多數(shù)蛋白質(zhì)來說通常為1～10μg/ml。

（3）　酶標(biāo)記工作濃度的選擇：用直接ELISA法進(jìn)行初步效價(jià)的滴定（見酶標(biāo)記部份）。然后再固定其它條件或采取“方陣法”（包被物、待檢樣品的參考品及酶標(biāo)記分別為不同的稀釋度）在正式實(shí)驗(yàn)里準(zhǔn)確地滴定其工作濃度。

（4）　酶的底物及供氫體的選擇：對供氫體的選擇要求是、安全、有明顯地顯色反應(yīng)，而本身無色。有些供氫體（如OPD等）有潛在的致癌作用，應(yīng)注意防護(hù)。有條件者應(yīng)使用不致癌、靈敏度高的供氫體，如TMB和ABTS是較為滿意的供氫體。底物作用一段時(shí)間后，應(yīng)加入強(qiáng)酸或強(qiáng)堿以終止反應(yīng)。通常底物作用時(shí)間，以10-30分鐘為宜。底物使用液新鮮配制，尤其是H2O2在臨用前加入。