本試劑盒只能用于科學(xué)研究，不得用于醫(yī)學(xué)診斷

牛XVII型膠原(COL17)ELISA試劑盒

使用說明書

檢測原理

試劑盒采用雙一步夾心法酶聯(lián)吸附試驗（ELISA）。往預(yù)先包被白蛋白（ALB）的包被微孔中，依次加入標(biāo)本、品、HRP標(biāo)記的檢測，經(jīng)過溫育并洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成終的。顏色的深淺和樣品中的白蛋白（ALB）呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），計算樣品濃度。

操作步驟：1.從室溫平衡 20min 后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回 4℃。2. 設(shè)置品孔、樣本孔和空白孔，空白孔什么都不加；品孔各加不同濃度的品 50μL；3. 待測樣本孔先加待測樣本 10μL，再加樣本稀釋液 40μL；4. 隨后品孔和樣本孔中（空白孔不加）加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測 50μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育 60min。5. 棄去，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置 1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗 板 5 次（也可用洗板機洗板）。6. 所有孔加入底物 A、B 各 50μL，37℃避光孵育 15min。7. 所有孔加入終止液 50μL，15min 內(nèi)，在 450nm 波長處測定各孔的 OD 值。

操作步驟：1.從室溫平衡 20min 后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回 4℃。2. 設(shè)置品孔、樣本孔和空白孔，空白孔什么都不加；品孔各加不同濃度的品 50μL；3. 待測樣本孔先加待測樣本 10μL，再加樣本稀釋液 40μL；4. 隨后品孔和樣本孔中（空白孔不加）加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測 50μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育 60min。5. 棄去，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置 1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗 板 5 次（也可用洗板機洗板）。6. 所有孔加入底物 A、B 各 50μL，37℃避光孵育 15min。7. 所有孔加入終止液 50μL，15min 內(nèi)，在 450nm 波長處測定各孔的 OD 值。

樣品收集、處理及保存

1.  ：使用不含熱原和內(nèi)的試管，操作中避免任何細(xì)胞，收集血液后，3000轉(zhuǎn)離心10分鐘將和紅細(xì)胞迅速小心地分離。

2.  ：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000轉(zhuǎn)離心30分鐘取上清。

3.  細(xì)胞上清液：3000轉(zhuǎn)離心10分鐘去除顆粒和聚合物。

4.  組織勻漿：將組織加入適量鹽水搗碎。3000轉(zhuǎn)離心10分鐘取上清。

5.  保存：如果樣本收集后不及時檢測，請按一次用量分裝，凍存于-20℃，避免反復(fù)凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

自備物品

1. 酶標(biāo)儀（450nm）

2. 加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3. 37℃恒溫箱

用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成終的。顏色的深淺和樣品中呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。

操作注意事項

1.  試劑盒保存在2-8℃，使用前室溫平衡20分鐘。從冰箱取出的濃縮洗滌液會有結(jié)晶，這屬于正常現(xiàn)象，水浴加熱使結(jié)晶完全溶解后再使用。

2.  實驗中不用的板條應(yīng)立即放回自封袋中，密封（低溫干燥）保存。

3.  濃度為0的S0號品即可視為陰性對照或者空白；按照說明書操作時樣本已經(jīng)稀釋5倍，終結(jié)果乘以5才是樣本實際濃度。

4.  嚴(yán)格按照說明書中標(biāo)明的時間、加液量及順序進(jìn)行溫育操作。

5.  所有組分使用前充分搖勻。

試劑的

 20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋，即1份的20×洗滌緩沖液加19份的蒸餾水。

洗板

1.  手工洗板：甩盡孔內(nèi)，每孔加滿洗滌液，靜置1min后甩盡孔內(nèi)，在吸水紙上拍干，如此洗板5次。

2.  自動洗板機：每孔注入洗液350μL，浸泡1min，洗板5次。

操作步驟

1.  從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。

2.  設(shè)置品孔和樣本孔，品孔各加不同濃度的品50μL；

3.  樣本孔先加待測樣本10μL，再加樣本稀釋液40μL；空白孔不加。

4.  除空白孔外，品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

5.  棄去，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機洗板）。

6.  每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.  每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長處測定各孔的OD值。

結(jié)果判斷

 繪制曲線：在Excel工作表中，以品濃度作橫坐標(biāo)，對應(yīng)OD值作縱坐標(biāo)，繪制出品線性回歸曲線，按曲線方程計算各樣本濃度值。

操作注意事項：1. 試劑盒保存在 2-8℃，使用前室溫平衡 20 分鐘。從冰箱取出的濃縮洗滌液會有結(jié)晶，這屬于正常現(xiàn)象，水浴加熱使結(jié)晶完全溶解后再使用。2. 實驗中不用的板條應(yīng)立即放回自封袋中，密封（低溫干燥）保存。3. 濃度為 0 的品可視為陰性對照或者空白；按照說明書操作時樣本已經(jīng)稀釋 5 倍，終結(jié)果乘以5才是樣本終濃度。4. 嚴(yán)格按照說明書中標(biāo)明的時間、加液量及順序進(jìn)行溫育操作.5. 所有組分使用前充分搖勻。6. 若中英文說明書有誤，請以中文說明書為準(zhǔn)。7. 20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按 1：20 稀釋，即 1 份的 20×洗滌緩沖液加 19 份的蒸餾水。8. 不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3辣根過氧化物酶的（HRP）活性。

試劑盒性能

1.  準(zhǔn)確性：品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值，大于等于0.9900。

2.  靈敏度檢測濃度小于1.0 mg/mL。

3.  特：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)。

4.  重復(fù)性：板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于15%。

5.  貯藏：2-8℃，避光防潮保存。

6.  有效期：6個月

免責(zé)聲明

1.   試劑盒僅供研究使用，不得用于臨床實驗或人體實驗，否則所產(chǎn)生的一切后果，由實驗者承擔(dān)，本公司概不負(fù)責(zé)。

2.   嚴(yán)格按照說明書操作，實驗者違反說明書操作，后果由實驗者承擔(dān)。