人封閉蛋白3(CLDN3)ELISA試劑盒

ELISA檢劑盒應(yīng)用定性?shī)A心檢測(cè)技術(shù)，用合成的HEV多肽抗原包被微孔板板條，這些多肽是型HEV毒株核心酸序列中抗原性很強(qiáng)的肽段，分別來(lái)自于該毒株的開(kāi)放閱讀框2和開(kāi)放閱讀框3。將樣品或品加入孔中并孵育，如果其中存在HEV IgM，這些就會(huì)與HEV 的多肽抗原結(jié)合，并固定在上面，洗板除去其它非特和樣品中的其它成份。然后加入羊抗人IgM-HRP（辣根過(guò)氧化物酶）酶結(jié)合物，經(jīng)第二次孵育后，酶結(jié)合物就會(huì)與次孵育結(jié)合上的HEV IgM相結(jié)合，洗板除去未結(jié)合的酶結(jié)合物，加入TMB底物溶液，在第三次孵育時(shí)會(huì)發(fā)生酶-底物反應(yīng)，只有那些含有HEV IgM和酶結(jié)合物所形成的復(fù)合物的孔才會(huì)發(fā)生顏色變化，加入溶液終止酶和底物間的反應(yīng)，并在波長(zhǎng): 450nm處測(cè)量O.D.值,按照本HEV IgMelisa試劑盒的, O.D.值大于或等于Cut-Off值的樣品被認(rèn)為是初試陽(yáng)性。

組成結(jié)構(gòu)：

1、 ：操作中避免任何細(xì)胞。使用不含熱原和內(nèi)的試管。收集血液后，1000×g離心10分鐘將血紅細(xì)胞迅速小心地分離。

2、 ：EDTA、檸檬酸鹽、肝素可用于檢測(cè)。1000×g離心30分鐘去除顆粒。

3、 細(xì)胞上清液：1000×g離心10分鐘去除顆粒和聚合物。

4、 組織勻漿：將組織加入適量鹽水搗碎。1000×g離心10分鐘，取上清液。

5、 保存：如果樣品不立即使用，應(yīng)將其分成小部分-70℃保存，避免反復(fù)冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果中大量顆粒，檢測(cè)前先離心或過(guò)濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應(yīng)在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

此IBL試劑盒能用于小鼠,EDTA,細(xì)胞上清中白介素-6的定量檢測(cè)

試劑盒成分

1 預(yù)包被板: 抗小鼠白介素-6兔子IgG,親合純化 96T

2 酶標(biāo)記: (30倍濃縮)HRP標(biāo)記抗小鼠白介素-6兔子IgG,親合純化 0.4mL x 1

3 品: 重組小鼠白介素-6 0.5mL x 2

4 EIA緩沖液: 含1% BSA, 0.05%吐溫20 BPS 30mL x 1

5 標(biāo)記稀釋液: 含1% BSA, 0.05%吐溫20 BPS 12mL x 1

6 顯色劑: TMB底物液 15mL x 1

7 終止液: 1N 12mL x 1

8 濃縮洗滌液: (40倍濃縮) 含1% BSA, 0.05%吐溫20 BPS 50mL x 1 操作說(shuō)明 1實(shí)驗(yàn)所需器材(但試劑盒沒(méi)有提供) 酶標(biāo)儀(450nm) 微移液管及其吸嘴 量筒及燒杯 去離子水 冰箱(4°C) 坐標(biāo)紙(log/log) 吸水紙 試管(用于品稀釋) 溫育箱(37°C ± 1°C) 洗瓶 (用于洗板) 一次性試劑管(用于濃縮酶標(biāo)記和顯色劑)

ELISA試劑盒的用法包括以下步驟：1.包被：用PH9.6的CBS包被液稀釋包被抗原至5μg/ml，酶標(biāo)板中每孔加入50μl，室溫、4℃或37℃過(guò)夜包被。2.洗滌：棄包被液（拍干，再用無(wú)塵紙吸干），用PH7.2-7.4的1×PBST洗滌液洗板3次（每孔均要加滿），每次3min~5min。3.封閉：每孔加封閉液（1%BSA）250μl，37℃封閉2h。4.洗滌：用1×PBST洗滌液洗板3次，每次3min~5min。5.加樣：加入已經(jīng)稀釋好的樣品，37℃反應(yīng)1h。一般樣本加入50-100μl，充分混勻。6.洗滌：用洗滌液洗板3次，每次3min~5min。7.加入酶標(biāo)試劑：每孔加入100μl酶標(biāo)溶液，37℃，1h。8.洗滌：用洗滌液洗板3次，每次3min~5min。9.顯色：每孔先加入顯色劑A液50μl，再加入顯色劑B液50μl，37℃避光10-15min。10.終止及測(cè)定：加入50μl終止液，終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)OD值。

酶聯(lián)吸附法（ELISA）是一種靈敏、特異的學(xué)技術(shù)，常用于醫(yī)學(xué)、生物領(lǐng)域中的抗原或檢測(cè)。其作用包括：1.診斷：ELISA可以用于檢測(cè)或組織樣本中的特定分子，如抗原、抗原、標(biāo)志物等，協(xié)助進(jìn)行診斷。2.檢測(cè)：ELISA可以用于檢測(cè)血液中的，如乙型表面、人類缺陷等，用于流行病學(xué)調(diào)查和臨床診斷。3.評(píng)估：ELISA可以用于檢測(cè)后的以及劑量對(duì)的化學(xué)反應(yīng)等，幫助對(duì)患者進(jìn)行個(gè)性化。4.生物分子檢測(cè)：ELISA可以用于檢測(cè)生物分子，如蛋白質(zhì)、多肽、等，在生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。總之，酶聯(lián)吸附法在醫(yī)學(xué)、生物領(lǐng)域中具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值，是臨床診斷和中重要的輔助手段。

人封閉蛋白3(CLDN3)ELISA試劑盒

試驗(yàn)原理

試劑盒是固相夾心法酶聯(lián)吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）.已知濃度的品、未知濃度的樣品加入微孔酶標(biāo)板內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。先將生物素標(biāo)記的同時(shí)溫育。洗滌后，加入親和素標(biāo)記過(guò)的HRP。再經(jīng)過(guò)溫育和洗滌，去除未結(jié)合的酶結(jié)合物，然后加入底物A、B，和酶結(jié)合物同時(shí)作用。產(chǎn)生顏色。顏色的深淺和樣品中的濃度呈比例關(guān)系。

自備材料

1． 蒸餾水。

2． 加樣器：5ul、10ul、50ul、100ul、200ul、500ul、1000ul。

3． 振蕩器及磁力攪拌器等。

安全性

1． 避免直接終止液和底物A、B。一旦到這些，請(qǐng)盡快用水沖洗。

2． 實(shí)驗(yàn)中不要吃喝、抽煙或使用化妝品。

3． 不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份。

4． 試劑應(yīng)按標(biāo)簽說(shuō)明書(shū)儲(chǔ)存，使用前恢復(fù)到室溫。稀稀過(guò)后的品應(yīng)丟棄，不可保存。

5． 實(shí)驗(yàn)中不用的板條應(yīng)立即放回包裝袋中，密封保存，以免變質(zhì)。

6． 不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好。不同批號(hào)的試劑不要混用。保質(zhì)前使用。

7． 使用一次性的吸頭以免交叉污染，吸取終止液和底物A、B液時(shí)，避免使用帶金屬部分的加樣器。

8． 使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。

9． 洗滌酶標(biāo)板時(shí)應(yīng)充分拍干，不要將吸水紙直接放入酶標(biāo)反應(yīng)孔中吸水。

10． 底物A應(yīng)揮發(fā)，避免長(zhǎng)時(shí)間打開(kāi)蓋子。底物B對(duì)光，避免長(zhǎng)時(shí)間于光下。避免用手，有毒。實(shí)驗(yàn)完成后應(yīng)立即讀取OD值。

11． 加入試劑的順序應(yīng)一致，以所有反應(yīng)板孔溫育的時(shí)間一樣。

12． 按照說(shuō)明書(shū)中標(biāo)明的時(shí)間、加液的量及順序進(jìn)行溫育操作。

人封閉蛋白3(CLDN3)ELISA試劑盒

做好對(duì)照

正式試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)分別以陽(yáng)性對(duì)照與陰性對(duì)照控制試驗(yàn)條件，待檢樣品應(yīng)作一式二份，以實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。有時(shí)本底較高，說(shuō)明有非特反應(yīng)，可采用羊、兔或BSA等封閉。

實(shí)驗(yàn)條件的選擇

在ELISA中，進(jìn)行各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)條件的選擇是很重要的，其中包括:

（1）　固相載體的選擇：許多可作為固相載體，如聚氯、聚、聚丙酰胺和纖維素等。其形式可以是凹孔平板、試管、珠粒等。常用的是40孔聚凹孔板。不管何種載體，在使用前均可進(jìn)行篩選：用等量抗原包被，在同一實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行反應(yīng)，觀察其顯色反應(yīng)是否均一性，據(jù)此判明其吸附性能是否良好。

（2） 包被（或抗原）的選擇：將（或抗原）吸附在固相載體表面時(shí)，要求純度要好,吸附時(shí)一般要求PH在9.0～9.6之間。吸附溫度，時(shí)間及其蛋白量也有一定影響,一般多采用4℃ 18～24小時(shí)。蛋白質(zhì)包被的適濃度需進(jìn)行滴定：即用不同的蛋白質(zhì)濃度（0.1、1.0和10μg/ml等）進(jìn)行包被后，在其它試驗(yàn)條件相同時(shí)，觀察陽(yáng)性標(biāo)本的OD值。選擇OD而蛋白量少的濃度。對(duì)于多數(shù)蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)通常為1～10μg/ml。

（3）　酶標(biāo)記工作濃度的選擇：用直接ELISA法進(jìn)行初步效價(jià)的滴定（見(jiàn)酶標(biāo)記部份）。然后再固定其它條件或采取“方陣法”（包被物、待檢樣品的參考品及酶標(biāo)記分別為不同的稀釋度）在正式實(shí)驗(yàn)里準(zhǔn)確地滴定其工作濃度。

（4）　酶的底物及供氫體的選擇：對(duì)供氫體的選擇要求是、安全、有明顯地顯色反應(yīng)，而本身無(wú)色。有些供氫體（如OPD等）有潛在的致癌作用，應(yīng)注意防護(hù)。有條件者應(yīng)使用不致癌、靈敏度高的供氫體，如TMB和ABTS是較為滿意的供氫體。底物作用一段時(shí)間后，應(yīng)加入強(qiáng)酸或強(qiáng)堿以終止反應(yīng)。通常底物作用時(shí)間，以10-30分鐘為宜。底物使用液新鮮配制，尤其是H2O2在臨用前加入。

ELISA試劑盒檢測(cè)中的注意事項(xiàng)

1、要移液槍的準(zhǔn)確性，誤差不能超過(guò)2%。可用水和電子天平進(jìn)行確定。有人員進(jìn)行矯正。

2、要配備20ul、50ul、100ul、1000ul和排槍各一支。吸取不同的后，要更換槍頭。即使是吸取品時(shí)。

3、要在實(shí)驗(yàn)前1小時(shí)將試劑盒從冰箱中取出，使各種試劑都恢復(fù)到室溫，以使結(jié)果更。

4、實(shí)驗(yàn)時(shí)，要使底物避光保存。

5、用槍吸取時(shí)速度不能太快，以免產(chǎn)生氣泡而使吸取量不準(zhǔn)確。

6、吸取時(shí)，要用量程和需要量接近的槍去吸，誤差。

7、將加到酶標(biāo)孔中時(shí)，避免槍頭和孔內(nèi)，可使槍頭上的液滴和孔壁，液滴會(huì)自然流下去。

8、全部加完后，可將酶標(biāo)板在桌子上平行輕輕晃動(dòng)30秒，混勻。也可以用酶標(biāo)儀的晃動(dòng)功能。

9、溫浴時(shí)，要用不干膠或膠帶紙封好酶標(biāo)板，防止水分的蒸發(fā)。

10、洗板時(shí)，每次洗液加入后，應(yīng)靜置1分鐘，使清洗更加。沒(méi)有洗板機(jī)時(shí)，倒去后，要將酶標(biāo)板在報(bào)紙或毛紙上拍干。

11、洗液不夠時(shí)，可用蒸餾水自行配制PH7.4，0.02M的緩沖液，加入0.1%的吐溫20作為洗液。加入1/1000的疊氮鈉后可長(zhǎng)期保存。

12、底物是光的，要在臨用前現(xiàn)配。

13、檢測(cè)前，要打開(kāi)酶標(biāo)儀，使之10分鐘以上。

14、底物有一定的毒性，終止液對(duì)皮膚有腐蝕性，應(yīng)盡量避免。

15、待檢樣品要澄清，否則會(huì)影響結(jié)果。

16、溫浴時(shí)間應(yīng)遵守試劑盒規(guī)定。

17、應(yīng)盡量做雙孔實(shí)驗(yàn)，這樣才能數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。

18、對(duì)結(jié)果有疑問(wèn)的樣品要用其它進(jìn)行確證。